Western免疫印迹
原理：
Western免疫印迹( Western Blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。与 Southern或 Northern杂交方法类似，但 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜（NC膜）或PVDF膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验过程
（一）蛋白样品制备
1.
单层贴壁细胞总蛋白的提取
（1）吸净培养液。
（2）加4℃ 预冷的PBS。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液，将培养皿置冰上。
（3）按1 ml RIPA裂解液（强）+ 10 ul PMSF（100 mM）+ 10 ul磷酸酶抑制剂 + 10 ul蛋白酶抑制剂配置裂解液，摇匀置于冰上。
（4）
加入适量裂解液（12孔板加100 ul，6孔板加200 ul）后，用枪吹洗数下，使裂解液和细胞充分接触。于摇床上100转左右低温（冰上）裂解15 min。
（5）裂解完后，用干净的吸头将细胞刮于1.5 ml 离心管（动作要快）。（整个操作尽量在冰上进行。）
（6）于4℃下14000 rcf离心10 min。（提前开离心机预冷）
（7）
将离心后的上清转移到1.5 ml的离心管中。
（8）做BCA蛋白定量。
（9）加25 ul 5×loading buffer，震荡混匀，100 ℃加热10 min。
（10）-80度保存。
2.
组织中总蛋白的提取
（1）将少量组织块置于2 ml圆底离心管中，加2-3个钢珠。
（2）加适量（500 ul-1 ml）裂解液（含PMSF）于离心管中，进行匀浆（重复两到三次，使组织尽量碾碎），然后置于冰上。
（3）
裂解完成后，4℃下14000 rpm离心10 min，取上清分装于1.5 ml离心管中并置于－80℃保存。
（二） 蛋白含量的测定
1.
制作标准曲线
（1）从－20℃取出1 mg/ml BSA，室温融化后，备用。
（2）取18个1.5 ml离心管，3个一组，分别标记为0 mg，2.5 mg，5.0 mg，10.0 mg，20.0 mg，40.0 mg。
（3）按下表在各管中加入各种试剂。
（4）
混匀后，室温放置2 min。在生物分光光度计（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色分析。
2.
检测样品蛋白含量
（1）取足量的1.5 ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1 ml。室温放置30 min后即可用于测蛋白。
（2）
取一管考马斯亮蓝加0.15 mol/L NaCl溶液100 ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
（3）弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 mL），再用无菌水洗一次。
（4）取一管考马斯亮蓝加95 ml 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 ml待测蛋白样品，混匀后静置2 min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 ml样品含的蛋白量。
（三）SDS－PAGE电泳
1. 清洗玻璃板：
玻璃板先用洗手液擦洗后，用蒸馏水冲洗干净并烘干。
灌胶与上样：
（1） 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶（操作时要使两玻璃对其，以免漏胶）。
（2） 选择分离胶浓度（赛维尔试剂盒）：根据目标蛋白分子量选择适当凝胶浓度，蛋白分子量与凝胶浓度参考下表建议：
（3） 配置分离胶：
（4） 灌制分离胶：加入TEMED后立即摇匀即可灌胶，一块玻璃板大概加7.5 ml分离胶，灌胶后加1 ml超纯水液封。
（5） 静置20-30 min 后将胶面的水倒出，倒立沥干水，洗适当孔数的梳子并烘干。
（6） 配置浓缩胶：
（7） 灌制浓缩胶：加入TEMED后，可加染料（500:1），立即摇匀即可灌胶，一块玻璃板约加2 ml分离胶，灌胶后立即插入梳子，勿产生气泡。
（8） 静置20-30 min后制胶完成。
3. 上样电泳：
（1） 配电泳液：1袋电泳缓冲液干粉+1 L超纯水。
（2） 用dd H2O冲洗一下制好的胶，将其放入电泳槽内（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，槽的另一边要垫一块塑料板且有字一面朝外）。
（3） 将电泳液倒入两块胶之间，垂直取出梳子，将上样孔间距调节一致后准备上样。加样时防止样品溢出。
（4） 电泳：调节参数（70-80V，30 min保持电流在50 mA以下），当样品跑到分离胶时，调整参数（100-110V，60 min）,电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
4. 将胶上的蛋白转移到PVDF膜上
（1）转膜前准备：
a. 配置转膜液：1袋转膜缓冲液干粉+800 ml超纯水+200 ml甲醇。配置好的转膜液要冰浴或放4℃冰箱提前降温。
b. 转一张膜需要准备：2张海绵+2张滤纸（转膜液提前泡软）+1张PVDF膜（需提前甲醛泡5 min）。
c. 纯水洗净托盘，镊子，小刀，圆珠笔，排气泡离心管。
（2）转膜：
a. 将转膜槽放入冰盆中；托盘中倒入转膜液。
b. 将转膜的夹子打开，黑色一面保持水平放入托盘，上面放一层海绵垫，一层滤纸。取出电泳结束后的胶，撬开玻璃板，切去浓缩胶，用超纯水冲洗胶面。将冲洗干净的胶平整放到滤纸上，将PVDF膜在转膜液种泡制30 s后覆盖到胶上，用排气泡的离心管将胶与膜之间的气泡排出，再盖一层滤纸，一层海绵垫后将夹起来，放到转膜槽中。（要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。）
c. 调节参数（100-110 V，90 min，保持电流在200 m A左右，低于250 mA）。
5. 封闭
（1）准备牛奶：每张膜大概需要5 ml牛奶封闭，牛奶需要用TBST和脱脂奶粉配置（5 %）。
（2）转膜完成后将电泳液倒入托盘，取出PVDF膜后，在条带上用圆珠笔做好标记，并将膜上所需的条带裁剪下来，用TBST洗三次（每次1 min，放置在摇床上130-140转）。
（3）吸净TBST后倒入牛奶封闭1 h，放置在摇床上55-65转。
6. 孵育一抗
（1）稀释一抗（50 ml离心管中）:将一抗用TBST稀释至适当浓度后放冰上。
（2）将封闭结束的条带用TBST在摇床上洗3次，每次1 min；用纸吸去条带上的TBST后，将条带放入一抗稀释液中4 ℃摇床上孵育过夜（12-18 h）。
7. 孵育二抗
（1）稀释二抗（50 ml离心管中）：将二抗用封闭用的牛奶稀释至适当浓度（1:5000），放到摇床上混匀。
（2）将条带从一抗稀释液中取出，用TBST在摇床上洗3次，每次10 min；
（3）吸净TBST后倒入二抗稀释液孵育1 h，在摇床上55-65转。
8. 化学发光
（1）配置发光液：每个条带约需200 ml发光液。（stock A:stock B=1:1）
（2）将孵完二抗的条带用TBST在摇床上洗4次，每次10 min；最后用纸吸去条带上的TBST后，用仪器曝光。
（3）实验结束后的条带干燥保存。