HCR’s Lab Immunoprecipitation protocol

Aspirate media. Treat cells by adding fresh media containing regulator for desired time.

To harvest cells under nondenaturing conditions, remove media and rinse cells once with ice-cold PBS.

Remove PBS and add 0.5 ml ice-cold 1X cell lysis buffer to every well and incubate the plates on ice for 5 minutes.

Scrape cells off the plates and transfer to microcentrifuge tubes. Keep on ice.

Maintain cell lysis agitation for 15 min at 4°C.


Microcentrifuge for 10 minutes at 14,000 X g, 4°C, and transfer the supernatant to a new tube. If necessary, lysate can be stored at –80°C.

Keep 100ul as Total cell lysis

Take 400 μl cell lysate and add 25ul Protein G agarose for pre-clearing.

Incubate at 4°C for 30 minutes. Spin for 10 minutes at 4°C. Transfer the supernatant to a fresh tube.

Add primary antibody(1~5ug/ml). Incubate with gentle rocking overnight at 4°C.

Add   protein   G agarose beads (60 μl of 50% bead slurry). Incubate with gentle rocking for 4 hours at 4°C.

Microcentrifuge for 10mins at14,000 X g 4°C. Wash pellet five times with 500 µl of 1X cell lysis buffer. Keep on ice during washes. Repeat 3times.

Resuspend the pellet with 60 μl 2X SDS sample buffer. Vortex, then microcentrifuge for 30 seconds. the   IP pellet can be stored at –80°C.

Heat the sample to 95–100°C for 5 minutes and microcentrifuge for 1 minute at 14,000 X g.   Load the sample on SDS-PAGE gel (4–20%).Analyze sample by Western blotting

1   .配裂解液 Mix：1 ml Western 及 IP 裂解液+10 ul 磷酸酶抑制剂+10 ul 多种酶抑制剂+10 ul PMSF。

取出细胞，将培养基吸干净，用预冷的 PBS 洗一遍，吸去 PBS。

每孔加 0.5 ml 裂解液 Mix，冰上 100 转左右摇 15 min 。

将细胞从培养皿上刮下来，转移到 1.5 ml 离心管中。

4 ℃，14000 g，离心10 min，将上清液转移到新试管中（100 ul + 400 ul）。

取 100 ul细胞裂解液，加 5× loading buffer，100 ℃ 加热10 min，-80度保存。蛋白变性后跑WB 测总蛋白含量。

取 400 ul 细胞裂解液，加 25 ul Protein A/G 琼脂糖珠进行珠子预处理。

于 4 ℃ 孵育 30 min 。4 ℃ ，14000g，离心 10 min ，将上清转移到新的 1.5 ml 离心管。

加入一抗（ 1 ~ 5   ug/ml )，在 4 ℃ 下轻摇孵育过夜。

加60ulProtein A/G 琼脂糖珠，在 4 °C 下温和摇晃 4 h。

于 4 ℃，14000 g，离心10 min，去上清。

加500 µl 的裂解液 Mix 洗涤珠子（吹打，颠倒混匀） ，4 ℃，摇10 min。

于 4 ℃，14000 g，离心10 min，去上清。

重复12-13步骤，共洗三次后去上清。

用 60 μl 2X loading buffer 重悬珠子，旋涡，瞬离 30 s。

将样品于 100 °C 加热 10 min，-80度保存。样品进行电泳分析。

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