南京医科大学外科感染与免疫临床转化研究中心
Clinical transformation research center of surgical infection and immunity, Nanjing Medical University

细胞培养

细胞复苏

1.准备工作:水浴锅37℃,血清4解冻,PS常温解冻,不完全培养基一瓶,50ml离心管

2.配完全培养基:500ml不完全培养基+55ml血清+25ml PS(双抗),分装至50ml离心管

3.将细胞从液氮罐取出,镊子夹住放37~40℃,轻摇1min左右至融化

4.转至超净台,取15ml离心管+4ml完全培养基+融化的细胞

5.离心1000rpm,3minRT

6.弃上清,加2ml完全培养基重悬细胞

7.取10cm的培养皿+8ul完全培养基+2ml细胞,显微镜下观察后,放入培养箱

细胞传代

1.弃去培养基,加3ml预温的PBS洗两次

2.加2-3ml胰酶(RAW264细胞直接用PBS+EDTA吹打),放入培养箱3min消化

3.加3ml预温的完全培养基终止消化,将细胞全部吸至15ml离心管

4.离心 1000rpm,3min,RT

5.弃上清,用2ml-3ml完全培养基(按1:3~1:5传代)重悬细胞

6.取10cm的培养皿+8ul完全培养基+1ml细胞,显微镜下观察后,放入培养箱

细胞铺板

1.弃去培养基,加3ml预温的PBS洗两次

2.加2-3ml胰酶(RAW264细胞直接用PBS+EDTA吹打),放入培养箱3min消化

3.加3ml预温的完全培养基终止消化,将细胞全部吸至15ml离心管

4.离心 1000rpm,3min,RT

5.弃上清,用2m完全培养基重悬细胞,取15ul细胞计数板,进行细胞计数

6.铺6孔板(每孔细胞密度为10^6:培养基+细胞体系为500ul

铺12孔板(每孔细胞密度为10^5:培养基+细胞体系为1ml

7.“十”字或∞”字轻摇,混匀细胞后放入培养箱

细胞冻存

1.弃去培养基,加3ml预温的PBS洗两次

2.加2-3ml胰酶(RAW264细胞直接用PBS+EDTA吹打),放入培养箱3min消化

3.加3ml预温的完全培养基终止消化,将细胞全部吸至15ml离心管

4.离心 1000rpm,3min,RT

5.弃上清,用3ml细胞冻存液(90%血清+10%DMSO重悬细胞

6.将细胞分装至冻存管(每管1ml),4℃ 2H,-20 2H,-80 过夜,液氮保存。


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