提质粒

质粒转化及扩增：

配LB培养基（以1L为例）

（1）950 ml去离子水

（2）细菌用胰化蛋白酶bacto Tryptone 10g

（3）细菌用酵母提取物 bacto-yeast extract 5g

（4）Nacl 10g

（5）摇动至溶解，用5mol/L NaOH调PH至7.0

（6）加去离子水至总体积为1L

准备锥形瓶和蓝盖瓶，将培养基分装到锥形瓶里（每瓶100ml），蓝盖瓶装超纯水和剩余的培养基。用锡箔纸封锥形瓶口，蓝盖瓶的盖子拧松封锡箔纸。准备1.5ml、2ml、15ml的EP管和5ml枪头，一起高压蒸汽灭菌（程序5液体）。

将感受态细胞从-80冰箱拿出，迅速冰上融化至半融化状态。

若质粒在纸上，将质粒剪下，用灭菌的超纯水溶解（200ul）。

加1-10ng质粒至感受态细胞，勿吹打，冰上孵育30分钟。

42℃水浴45s，不要晃动，冰上2分钟。

加900ul培养基，将所有液体转移至新的1.5ml的Ep管

细菌摇床37℃摇1h以上至浑浊。

10.取50-100ul滴到选择性培养皿，划平板，37℃倒置培养过夜。

11.取15ml离心管+5ml培养基+5ul抗生素+4-6个菌落，摇至浑浊

12.取锥形瓶+100ml培养基+100ul抗生素+5ml菌液，摇过夜

质粒提取（天根试剂盒）：

取50ml离心管，每次加50ml菌液，5000rpm,RT,离心5min,弃上清，至所有菌液都转移至离心管。

用1ml枪吸除上清。

向沉淀中加3mlP1，涡旋混匀

加3mlP2,温和上下翻转6-8次，静置5min

加1.5mlE3，立即上下翻转6-8次。出现白色絮状物

静置5min,5000rpm,离心30min

将上清慢慢推动过CPS1，将上清收集在15ml离心管

柱平衡：在CP7中加入2mlBL，5000rpm,离心2min,弃废液

向滤液中加入等体积的EBT，立即翻转7-10次

10.转移4ml混合液至cp7,RT,5000rpm,离心3min，弃废液，至所有混合液都通过cp7

11.加2mlGDE，5000rpm,RT,3min,弃废液

12.加3mlMRDE,5000rpm,离心3min,弃废液

13.加3.5mlPWF，5000rpm,离心3min,弃废液

14.重复步骤13

15.5000rpm,离心10min,空甩

16.开盖2min,晾干

17.将cp7放入一个新的15ml离心管，加TB 600ul，静置2min

18.5000rpm,RT,5min

19.转移至新的EP管，Nanodrop测浓度