南京医科大学外科感染与免疫临床转化研究中心
Clinical transformation research center of surgical infection and immunity, Nanjing Medical University

提质粒

质粒转化及扩增

LB培养基(以1L为例)

(1)950 ml去离子水

(2)细菌用胰化蛋白酶bacto Tryptone 10g

(3)细菌用酵母提取物 bacto-yeast extract 5g

(4)Nacl 10g

(5)摇动至溶解,用5mol/L NaOHPH7.0

(6)加去离子水至总体积为1L

准备锥形瓶蓝盖瓶将培养基分装到锥形瓶里(每瓶100ml蓝盖瓶装超纯水和剩余的培养基。用锡箔纸封锥形瓶口,蓝盖瓶盖子拧松封锡箔纸。准备1.5ml、2ml、15mlEP管和5ml枪头,一起高压蒸汽灭菌(程序5液体)。

将感受态细胞从-80冰箱拿出,迅速冰上融化半融化状态

质粒在纸上,将质粒剪下,灭菌的超纯水溶解200ul

1-10ng质粒至感受态细胞,勿吹打,冰上孵育30分钟。

42水浴45s,不要晃动,冰上2分钟。

900ul培养基,将所有液体转移至新的1.5mlEp

细菌摇床371h以上至浑浊

10.50-100ul滴到选择性培养皿,划平板37倒置培养过夜。

11.15ml离心管+5ml培养基+5ul抗生素+4-6个菌落,摇至浑浊

12.取锥形瓶+100ml培养基+100ul抗生素+5ml菌液,摇过夜

质粒提取(天根试剂盒)

50ml离心管,每次加50ml菌液,5000rpm,RT,离心5min,弃上清,至所有菌液都转移至离心管。

1ml枪吸除上清。

向沉淀中加3mlP1,涡旋混匀

3mlP2,温和上下翻转6-8次,静置5min

1.5mlE3,立即上下翻转6-8次。出现白色絮状物

静置5min,5000rpm,离心30min

将上清慢慢推动过CPS1,将上清收集在15ml离心管

柱平衡:在CP7中加入2mlBL5000rpm,离心2min,弃废液

向滤液中加入等体积的EBT,立即翻转7-10

10.转移4ml混合液至cp7,RT,5000rpm,离心3min,弃废液,至所有混合液都通过cp7

11.2mlGDE5000rpm,RT,3min,弃废液

12.3mlMRDE,5000rpm,离心3min,弃废液

13.3.5mlPWF5000rpm,离心3min,弃废液

14.重复步骤13

15.5000rpm,离心10min,空甩

16.开盖2min,晾干

17.cp7放入一个新的15ml离心管,加TB 600ul静置2min

18.5000rpm,RT,5min

19.转移至新的EP管,Nanodrop测浓度

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