提RNA具体步骤

一、组织研磨

准备材料：枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶

取2 ml离心管，加入1 ml的Trizol Reagent（大概可吸出900 ul）。

取组织，加入到离心管中。每个离心管内（最好用圆底离心管）加3个氧化锆珠子（提蛋白是用钢珠）。预冷离心机（4 ℃）。

组织放入研磨仪，2个循环（或3个），充分研磨直至无可见组织块。

二、细胞裂解

将细胞取出，吸去培养基后放冰上，6 孔板每孔加1 ml Trizol，12孔板每孔加500 ul Trizol.

冰上100转左右摇15 min

准备新的1.5 ml EP管，放冰上预冷，将细胞刮下加至EP管。

如果时间允许，可以直接提RNA，否则可以-80 ℃冻存。

三、提取RNA

1. 研磨后的组织（裂解后的细胞）静置5 min后，于4 ℃ 下12000 g离心5 min。 （接下来的操作转至通风橱）

2. 将上清转移至新的1.5 ml离心管中。

3. 加200 μl（1/5 Trizol体积）氯仿，正反颠覆离心管15下，充分混匀，室温静置5 min。

于4 ℃下12000 g离心15 min。

将上清转移到新的离心管中，加500 μl（0.5 - 1倍Trizol体积）异丙醇，正反颠倒15下混匀（轻柔）。

室温静置10 min。

于4 ℃下12000 g离心10 min，管底的白色沉淀即为RNA。

吸去液体，加入1 ml （等Trizol体积）75%乙醇洗涤沉淀。（每管先轻轻靠壁加进去，再用200 μl枪吹打，直到沉淀表面的有机物看不到为止）。

于4 ℃下7500 g离心5 min。

液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹10 min左右，直到沉淀变得透明或者半透明，几乎看不到为止。

加入40 μl DEPC水溶解RNA。（放冰上操作，DEPC在-4℃冰箱）。

Nanodrop测RNA浓度。机器使用前后要用ddH₂O清洗3次。

根据所测RNA浓度，将每管都调至1000 ng/ml (或500 ng/ml )体系（加DEPC水（无核糖核酸酶的去离子水）稀释）.

准备八联管，每孔取1 pg- 1 ng底物，加入4 μl 4×gDNA wiper Mix，补ddH₂0至体积为16 ul.

42 ℃，2 min，去除基因组DNA。

将样本冰上至通风橱，加4 ul 5×HiScript III qRT SuperMix，移液器轻轻吹打混匀。

37℃，15 min，85℃，5 s，反转录为cDNA。

-80度保存或立即用来做QPCR。

PS：

加入Trizol裂解 组织加入1ml 可以吸出大概900ul，或者略少于。

研磨组织不用使用无RNA/DNA酶的ep管，选择平底的2mlEP管（1.5ml难匀浆）。

3. 加氯仿，两块板夹着，快速上下颠倒混匀15下；加异丙醇，稍微轻一点上下颠倒混匀。

4. 取上清时，不要吸到沉淀，150ul吸2次多接近3次的量足够提取RNA。

5. 乙醇清洗沉淀前，吸取异丙醇，尽量吸干净，，沉淀贴壁牢固。在沉淀对侧底部吸取，上面可以吸的快点，接近沉淀最后一次吸的慢点。

6. 加入乙醇，沿壁加入，全部管打开，依次加入。

7. 200ul枪，沿着沉淀物对侧壁，沿壁吹动，能看沉淀物有油状物，轻轻吹吸，小心吸到沉淀物，吹的时候基本不会损伤。

8. 干燥时尽量等到变成半透明颜色，可减少有机物污染。等到沉淀变成半透明色再溶解。

9. 加入40ul depc水，一定记得混匀。

10.用中心实验室专用U盘考数据。