南京医科大学外科感染与免疫临床转化研究中心
Clinical transformation research center of surgical infection and immunity, Nanjing Medical University

RNA具体步骤

一、组织研磨

准备材料:枪头和离心管均经过湿热灭菌,无RNA

2 ml离心管,加入1 mlTrizol Reagent大概可吸出900 ul

取组织,加入到离心管中。每个离心管内(最好用圆底离心管)加3个氧化锆珠子(提蛋白是用钢珠)。离心机(4

组织放入研磨仪2个循环(或3个),充分研磨直至无可见组织块。

二、细胞裂解

将细胞取出,吸去培养基后放冰上,6 孔板每孔加1 ml Trizol12孔板每孔加500 ul Trizol.

冰上100转左右摇15 min

准备新的1.5 ml EP管,放冰上预冷,将细胞刮下加至EP管。

如果时间允许,可以直接提RNA,否则可以-80 ℃冻存。

三、提取RNA

1. 研磨后的组织(裂解后的细胞)静置5 min后,于4 12000 g离心5 min (接下来的操作转至通风橱)

2. 清转移至新的1.5 ml离心管中。

3. 200 μl1/5 Trizol体积)氯仿,正反颠覆离心管15下,充分混匀,室温静置5 min

4 12000 g离心15 min

将上清转移到新的离心管中,加500 μl0.5 - 1Trizol体积异丙醇,正反颠倒15下混匀(轻柔)。

室温静置10 min

4 12000 g离心10 min管底的白色沉淀即为RNA

液体,加入1 ml Trizol体积)75%乙醇洗涤沉淀。(每管先轻轻靠壁加进去,再用200 μl枪吹打,直到沉淀表面的有机物看不到为止)

4 7500 g离心5 min

液体吸除干净,将离心管置于超净台上吹10 min左右,直到沉淀变得透明或者半透明,几乎看不到为止。

加入40 μl DEPC水溶解RNA。(放冰上操作,DEPC-4冰箱)

NanodropRNA浓度。机器使用前后要用ddH2O清洗3次。

根据所测RNA浓度,将每管都调至1000 ng/ml (500 ng/ml )体系(加DEPC水(无核糖核酸酶的去离子水)稀释).

准备八联管,每孔1 pg- 1 ng底物,加4 μl 4×gDNA wiper MixddH20至体积为16 ul.

42 2 min去除基因组DNA

将样本冰上至通风橱,加4 ul 5×HiScript III qRT SuperMix移液器轻轻吹打混匀。

37℃,15 min85℃,5 s,反转录为cDNA

-80度保存或立即用来做QPCR


PS

加入Trizol裂解 组织加入1ml 可以吸出大概900ul,或者略少于。

研磨组织不用使用无RNA/DNA酶的ep管,选择平底的2mlEP管(1.5ml难匀浆)

3. 加氯仿,两块板夹着,快速上下颠倒混匀15加异丙醇,稍微轻一点上下颠倒混匀

4. 取上清时,不要吸到沉淀,150ul2次多接近3次的量足够提取RNA

5. 乙醇清洗沉淀前,吸取异丙醇,尽量吸干净,,沉淀贴壁牢固。在沉淀对侧底部吸取,上面可以吸的快点,接近沉淀最后一次吸的慢点

6. 加入乙醇,沿壁加入,全部管打开,依次加入。

7. 200ul枪,沿着沉淀物对侧壁,沿壁吹动,能看沉淀物有油状物,轻轻吹吸,小心吸到沉淀物,吹的时候基本不会损伤。

8. 干燥时尽量等到变成半透明颜色,可减少有机物污染。等到沉淀变成半透明色再溶解。

9. 加入40ul depc水,一定记得混匀。

10.用中心实验室专用U盘考数据


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