海洋启发的分子模拟产生无药物但免疫原性的水凝胶粘合剂，保护手术吻合

  本文以《Marine-inspired molecular mimicry generates a drug-free, but immunogenic hydrogel adhesive protecting surgical anastomosis 》为题，第一作者为黄金健。

摘要：

在此，我们报道了仿生水凝胶粘合剂的合成，其解决了手术吻合的不良愈合。多巴胺结合黄原胶（Da-g-Xan）是通过深入了解贻贝粘合剂和多巴胺之间的分子相似性以及藤壶水泥蛋白和黄原胶之间的结构相似性而制备的。水凝胶模拟海洋动物对湿组织表面的粘附。在将该粘合剂应用于大鼠模型中的结肠吻合时，通过显着改善破裂压力显示出保护作用。机械地，Da-g-Xan水凝胶的结构通过动态分子间氢键维持，其允许Da-g-Xan的快速释放。游离Da-g-Xan可通过与RNA测序和分子结合测定揭示的甘露糖受体（CD206）特异性相互作用来调节炎症状态并诱导2型巨噬细胞极化（M2）。因此，通过从M2巨噬细胞分泌趋化因子和生长因子，增强成纤维细胞迁移和增殖，胶原合成和上皮血管形成，产生用于组织愈合的适当微环境。总体而言，该研究证明了通过由两只海洋动物启发的协同模拟产生粘合剂的前所未有的策略，并且结果显示Da-g-Xan粘合剂增强了天然组织再生反应，从而能够在手术吻合后增强恢复。

图1：Da-g-Xan水凝胶胶黏剂的设计、合成、表征及分子基础。(A) EDC/NHS催化剂激活羧基，使多巴胺(Da)与黄原胶(Xan)结合，生成Da-g-Xan。(B) Da-g-Xan同时模仿贻贝的mfps和藤壶水泥蛋白的淀粉样结构，以作为粘合剂。(C) CD光谱显示Da-g-Xan具有高度有序且均匀的构象，优于黄原胶。(D) AFM图像直接显示Da-g-Xan链交错排列，排列方式类似藤蔓胶结蛋白的淀粉样纳米结构，增加了接触面。白色箭头:Da-g-Xan的双股螺旋。(E)多巴胺替代度和Da-g-Xan浓度可以调节Da-g-Xan的粘附强度。蓝色柱下的数字表示盐酸多巴胺与黄原胶中羧基的摩尔比;红色柱下的数字代表水凝胶粘合剂中Da-g-Xan 1.0共轭物的不同浓度。以盐酸多巴胺与黄原胶羧基的比例为1:1制备Da-g-Xan 1.0偶联物。(F) Da-g-Xan胶粘剂和组织表面之间的多重界面连接协同调节组织的强粘附。总之，增强的分子间氢键使Da-g-Xan水凝胶具有重构的微观结构和良好的性能，如自愈合、可注射性和可降解性。

图2：Da-g-Xan释放的免疫调节。(A) Panther富集过程中明显改变的通路显示Da-g-Xan可以调节巨噬细胞的炎症反应(左:i-iv)，右图显示相应通路的基因表达变化。(B)热图中典型炎症相关生物标志物的改变表明Da-g-Xan对炎症抑制的潜在免疫调节作用。(C)示意图显示结肠吻合口不可避免地分泌大量IFN-γ。(D)流式细胞术结果显示Da-g-Xan诱导IFN-γ预处理raw264.7巨噬细胞M2极化。(E)流式细胞术中巨噬细胞极化比例，%;每个重复N = 3， **p < 0.01， ***p < 0.001。(F)代表性标记物的改变进一步证实Da-g-Xan可诱导IFN-γ预处理raw264.7巨噬细胞M2极化;每个重复N = 3， *p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001。

图3：CD206介导Da-g-Xan和M2巨噬细胞极化的识别。（A） GO分析中15个最显着改变的碳水化合物结合分子基因。（B） Autodock Vina的计算机模拟揭示了不同Da-g-Xan单体与CD206之间的适度亲和力。（C） 蛋白质印迹分析表明Da-g-Xan及其反应物，无论多巴胺和黄原胶如何，都可以改善CD206的蛋白质表达。（D） 免疫荧光染色显示Da-g-Xan和CD206在raw264的细胞膜和细胞质中的共定位。7巨噬细胞。（E） 免疫斑点印迹分析表明Da-g-Xan与CD 206的特异性结合。（F） 通过shRNA敲低CD206阻碍由Da-g-Xan诱导的M2巨噬细胞极化；每个重复n=3，***p<0.001。（G） ERK信号传导的激活与Da-G-Xan诱导的M2巨噬细胞极化有关。敲低CD206略微降低ERK信号传导的激活并影响巨噬细胞极化。

图4：Da-g-Xan为组织修复创造了合适的微环境。(A) Da-g-Xan处理后细胞周期通路和趋化因子信号通路发生显著改变(上:i和ii)，底部显示相应通路的基因表达变化。(B) transwell实验显示，随着Da-g-Xan浓度的增加和培养时间的延长，raw264.7巨噬细胞的迁移能力有所提高。(C) CCK-8实验表明，随着Da-g-Xan浓度的增加和培养时间的延长，raw264.7巨噬细胞的增殖能力也有所提高;每个重复N = 3， *p < 0.05， ***p < 0.001。(D, E)酶联免疫吸附测定的细胞因子表明，随着Da-g-Xan浓度的增加和培养时间的延长，raw264.7巨噬细胞G-CSF和TGF-β的分泌增加;每个重复N = 3， *p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001。(F) transwell实验表明，使用Da-g-Xan处理的巨噬细胞的旁分泌作用可以进一步促进L929成纤维细胞的迁移，尽管Da-g-Xan单独也可以诱导迁移。(G) CCK-8实验表明，Da-g-Xan处理的巨噬细胞旁分泌作用可以进一步促进L929成纤维细胞的增殖，尽管Da-g-Xan单独也可以触发细胞增殖;每个重复N = 3， **p < 0.01， ***p < 0.001。(H) western blotting实验表明，Da-g-Xan处理巨噬细胞的旁分泌作用可以进一步改善L929成纤维细胞的胶原合成，尽管Da-g-Xan单独也可以实现胶原合成。(I)综上所述，Da-g-Xan在巨噬细胞旁分泌作用介导的成纤维细胞组织修复过程中具有级联扩增效应。

图5：Da-g-Xan改善大鼠模型中的结肠吻合愈合。（A） 用于构建具有不同干预的大鼠结肠吻合模型的特定外科手术，包括简单缝合，缝合纤维蛋白凝胶保护和缝合10%wt Da-g-Xan水凝胶保护。（B） x射线成像表明Da-g-Xan水凝胶粘合剂的额外处理不会在POD 7处引起肠梗阻。（C） 用于检测破裂压力的方法，破裂压力是压力传感器在连续注入密封结肠期间记录的最高压力。（D） 不同干预措施爆破压力的比较；每个重复n=5，*p<0.05。（E） HE和Masson染色的组织学分析显示，结肠吻合的愈合依赖于再生的肉芽组织进行所有干预，其中肉芽组织最厚，大部分胶原纤维沉积用于Da-g-Xan水凝胶治疗。（F） 定量分析肉芽组织和胶原纤维沉积的不同干预措施；每个重复n=5，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。（G） 通过对不同干预措施的血管生物标志物（CD31，α-SMA）染色，定量分析再生肉芽组织中新血管的形成；每个重复n=5，***p<0.001。（H） 流式细胞术结果显示，在所有干预措施中，用Da-g-Xan处理在再生肉芽组织中实现最高比例的M2巨噬细胞极化。（一） 定量分析不同干预措施的巨噬细胞极化比例，%；每个重复n=5，*p<0.05，**p<0.01。

结果：

1. 以贻贝和藤壶为灵感，合成了Da-g-Xan水凝胶粘合剂，具有多种应用优势

2. 释放的Da-g-Xan调节巨噬细胞的炎症状态，并在体外逆转细胞表型从M1到M2

3. CD206是Da-g-Xan的特异性结合受体，通过ERK信号通路介导M2巨噬细胞极化

4. 由Da-g-Xan触发的M2极化改善巨噬细胞的旁分泌作用，导致成纤维细胞的多种功能增强

5. Da-g-Xan水凝胶粘合剂在体内诱导M2巨噬细胞并通过改善血管形成和胶原沉积来保护手术吻合

结论：

受到两种海洋动物的启发，我们开发了Da-g-Xan水凝胶粘合剂，同时模拟mfp和藤壶水泥蛋白的淀粉样结构。该胶粘剂对脏器表面具有良好的粘附性能。与胶粘剂的非共价相互作用使Da- g-Xan快速腐蚀和释放。该多糖衍生物能够诱导巨噬细胞M2极化，为血管生成和成纤维细胞浸润创造适宜的微环境，为手术吻合口损伤修复奠定基础。我们目前的目标是将这种方法转化为一种可注射的、微创的解决方案，以挽救众多患者免受PAL的影响。